青い海、白い砂浜、色彩豊かな魚、心地よい潮風。

今となっては少なくなってきましたが、潮だまり(タイドプール)にもたくさんの生き物がいます。

そこは遊び場としてのパラダイスでもありました。

身近にいる海のいきものについて、子供から研究者まで楽しめるように紹介をしていきたいと思います。


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2009年06月02日

手作り装置だったHPLC

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私、イソガニ博士が最初に出会った本格的な実験は、高速液体クロマトグラフィー(HPLCと略します)でした。1983年のことです。

これはタンパク質ホルモンのアミノ酸配列を決めるために、化学的試薬で切断した後、あるいは酵素消化した後に、断片化したペプチドとなったものを精製する手段として使っていました。

この高速液体クロマトグラフィーは、今では一般的な分析機器となりましたが、当時は普及し始めの頃で、研究室にあった装置自体はメーカーの完成品でなく、いくつかのパーツを組み合わせたものでした。

このクロマトグラフィーでは、溶離液としてイソプロパノールの濃度勾配をつけて試料を溶出させるわけですが、そのために、100mL用のメスシリンダーを2連につなげて作ったものが工夫されて使われていました。

ガラス細工を応用した手作りのグラージェント装置なのです。絵にするとこんな↓感じです。

PIC132.jpg


これを送液ポンプへと接続して、インジェクター、カラム、UV検出器、フラクションコレクターの順でステンレス製の送液管がつないでありました。

これでも、当時としては最先端の分離・分析技術だったので、いかにも「研究をしている」といった雰囲気を感じさせてくれるものでした。

もちろん、出てきたデータも一級品で、この装置から多くの論文が生み出されました。



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2009年05月28日

エドマン分解から学んだこと

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私が大学4年生になろうとした時、「脳下垂体ホルモンのアミノ酸配列を決めてみたい」という単純(!?)な願いを持ちました。

しかし卒論で最初に取り組んだ実験は、アミノ酸配列を化学的に決定する手法の「エドマン分解」でなく、エドマン分解するためのサンプル調製でしたあせあせ(飛び散る汗)

その話は、また後日することにして、今日は「エドマン分解」について解説します。

エドマン分解とは、下↓の図に示したように、弱アルカリ条件下でペプチドのアミノ末端にフェニルイソチオシアネートを反応させ、次に酸処理により、アミノ端側にあるアミノ酸だけを切断させる手法です。
PIC130.jpg


これは、スウェーデンの生化学者ペール・エドマン (Pehr Victor Edman) により1950年に提唱されました。

そしてこれら一連の反応を繰り返し行い、新しくできたペプチドのアミノ末端をダンシルクロライドを使って順次分析することによって、アミノ酸配列を決定していきました(エドマン-ダンシル法といいます)。これは後々、上の図にあるように遊離したアミノ酸誘導体を高速液体クロマトグラフィーで同定する方法へ変わっていきます。

今では、プロテインシーケンサー(あるいはペプチドシークエンサー)と呼ばれる分析機器があるため、機械任せでアミノ酸配列を決めることが主流になりましたが、当時は手動で行っていました。

この「エドマン分解」によるアミノ酸配列決定では、アミノ末端から2〜3番目くらいの配列までは誰でも決めることができます。

ところが、10残基以上となると極めて難しい実験と言われていました。

理由は、1つ1つの反応を完璧に行う必要があったからです。

中途半端な反応を繰り返してしてしまうと、切れ残りがキャリーオーバーし、同定されるアミノ酸が複数になってしまって、配列が判らなくなってくるのです。

そのために、一度たりとも気を抜くことができない実験が連日のように続いたのでした。


しかしながら現在では、配列分析に適さなかったエドマン分解を上手にできない人が「アミノ酸配列を超微量分析で決定できる達人」として重宝される時代になりました。

つまり、いいかげんにエドマン分解を繰り返すと、切れ残りが発生し、いろいろな長さのペプチドの混合物となります。そうなってしまったサンプルを質量分析すると下↓のような結果となり、隣り合ったピークとの差からアミノ酸残基が決定できるのですひらめき
PIC131.jpg


高速液体クロマトグラフィーと質量分析の検出感度を比較すると、質量分析の方が優位なので、結果として「エドマン分解が上手にできない人」が超微量分析に適しているとなってきたのです。

このように「逆あるいは裏側」から物事を考えてみることの重要性を「エドマン分解」は教えてくれたのでした。


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posted by イソガニ博士 at 17:17| Comment(2) | TrackBack(0) | 研究方法 | このブログの読者になる | 更新情報をチェックする

2008年07月24日

甲殻類の神経組織を顕微鏡観察する

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今日は、研究者向けの話題を書きます。

動物の組織を顕微鏡観察する方法では、一般的に

組織の固定(ブアン固定など)→脱水→パラフィン包埋→スライス→脱パラフィン→染色

という操作をします。

実際にやってみると、けっこう手間と時間(2日程度)がかかってしまいます。

それでは、もっとお手軽な方法を紹介しましょう。

動物の組織→0.4%食塩水を使った凍結包埋→クリオスタットで切片化→乾燥→10%ホルマリンで固定(30分程度)→水洗→0.05%トルイジンブルー溶液で染色(1〜2分)→水洗→乾燥

という操作を行うことで、2〜3時間程度で組織の顕微鏡観察が行えます。

甲殻類の神経組織では、神経分泌細胞が濃い青で染まってくるので、観察しやすくなります。


アメリカザリガニの第六腹部神経節
PIC046.jpg



イソガニの胸部神経節

PIC047.jpg

フクロムシに寄生されたイソガニでは、これら神経分泌細胞↑が無くなっています。



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posted by イソガニ博士 at 07:56| Comment(2) | TrackBack(0) | 研究方法 | このブログの読者になる | 更新情報をチェックする

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