青い海、白い砂浜、色彩豊かな魚、心地よい潮風。

今となっては少なくなってきましたが、潮だまり(タイドプール)にもたくさんの生き物がいます。

そこは遊び場としてのパラダイスでもありました。

身近にいる海のいきものについて、子供から研究者まで楽しめるように紹介をしていきたいと思います。


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2009年06月29日

マリンバイオテクノロジーと成長へ

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魚に成長ホルモンを投与すると、どんどん体が大きくなっていきます。

しかし、成長ホルモンを養殖関連に応用するとなると、多くの問題点が浮かび上がってきました。

実験室レベルでは「注射する」という手法で行えますが、養殖業の現場となると、膨大な手間やコストが掛かってしまうので、そう簡単にはいきません。そのために、注射以外の投与法があるのか、ないのか検討をしなければなりません。

更に、成長ホルモン自体も大量に必要になることから、どのようにして調達するのか? これも大きな問題点となりました。

このような状況から、魚の成長ホルモンの研究はバイオテクノロジー活用へと時代は突入していきます。

そこで、自ら水産研究所を持ち、水産用医薬品の分野でもトップクラスの企業であった「協和発酵工業(株)」さんが成長ホルモンの研究に参画したのです。

(注:協和発酵工業(株)は水産研究所を平成16年10月に廃止しました。また、協和発酵工業(株)本体は現在、キリンホールディンクスに買収され、数社へと分社化されています)

そのためサケの成長ホルモンの構造は、タンパク質化学的には部分構造の決定に止め、全構造は遺伝子解析に委ねられました。更に、クローニングした成長ホルモン遺伝子を大腸菌内に大量発現させ、成長ホルモンの量産化へと進んでいくのでした。

投与法は、ホルモンを餌に混ぜることやホルモンを溶かした溶液に魚を浸す方法が提案され、どちらも「効果がある」という科学的なデータを得ることができました。

実験する準備段階では、成長ホルモンはタンパク質なので、胃腸によって消化されてしまって効果がでない、あるいは高分子物質のために腸や鰓などから吸収されないのではないかと危惧されましたが、病気のワクチン療法の分野で経口や浸透法において有効性があるとの報告が出てきたので、成長ホルモンの場合も大丈夫だろうとなったわけです。

このような研究成果は、ある全国新聞紙で、日ロ漁業交渉を題材に「大きなのはウチ(日本側)のもの」といった内容の風刺漫画にも使われました。

それから「マリンバイオテクノロジー」ブームの一端を担うことにもなったのでした。


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2009年06月26日

大きくしたい

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苦労の末、ようやく精製できたサケの成長ホルモンです。
次の興味は、どれくらい効果があるのかという点になりました。

学術的には「腹腔内投与」といって、成長ホルモンを溶かした生理食塩水をお腹の中へ注射して、その効果を検証することになります。

ニジマスを使った実験では、成長ホルモン液を注射した群は、生理食塩水だけを注射した群に比べて、明らかに体長、体重が増加してきました。

このような研究成果は、当時、沿岸漁業が衰退した代わりに育てる漁業を掲げていたが、いろいろな問題を抱えていた水産業にとって、明るい話題を提供することになりました。

そして、いくつかの企業も「サカナの成長ホルモン」へ興味を持ち始めたのでした。


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2009年06月24日

クロマトグラフィーをやめる勇気

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サケの成長ホルモンは、精製を繰り返すと回収されずに消えていきます。
実は、ここに単離を成功させるヒントが隠されていました。

ホルモンを高純度に精製するには、クロマトグラフィーによる分離が必要となります。ところが、このクロマトグラフィーを行うことで、サンプルが消失していくわけですから、思い切ってクロマトグラフィーすることを止めてしまったらどうなるか? という大胆な方向転換です。

ほとんどの脳下垂体ホルモンは、塩酸-アセトン抽出によって回収されます。しかし、ここでは成長ホルモンは抽出されてこないので、残った組織からアルカリ水溶液によってホルモンを再抽出することになりました。

そして、成長ホルモンが溶けている抽出液のペーハー(pH)を5.6に下げると、成長ホルモンが沈殿物として現れるのでした。等電点沈殿という手法です。

クロマトグラフィー法の発達によって、ホルモンの精製は「クロマト至上主義」といった感覚になっていました。そのような時に、クロマトグラフィーによる精製を極力、避けることは、かなり勇気のいる決断です。

そして、等電点沈殿といったひと昔前の手法へと回顧することで、成長ホルモンの大量精製が可能となったのです。

成長ホルモンの詳細な物理化学的特性を調べるには、高純度の標品が必要となります。そのために高純度の成長ホルモンの単離は、やはりクロマトグラフィーが必須になります。

サケの成長ホルモンでは、等電点沈殿物からSephadex G-100によるゲル濾過と高速液体クロマトグラフィーの2段階だけで精製を行うことになりました。

高速液体クロマトグラフィーでは、サケの成長ホルモンもプロラクチンと同じように2種類の分子として単離することができました。

結果からいうと、サケの成長ホルモンは変性を起こしやすく、溶液に溶けなくなってくるために、クロマトグラフィーによる精製が困難になっていたのです。また、凍結乾燥によるサンプルの保存も、溶けなくなる原因の1つとなっていました。


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2009年06月22日

試料が無くなる恐怖

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サケの成長ホルモンは、酸性溶液ではうまく抽出されません。
そのため、いろいろな抽出法を試した結果、アルカリ水溶液で抽出を行うとよいことが分かってきました。

ところが、クロマトグラフィーによる精製を行うと、抽出物の段階では存在していたはずの成長ホルモンが消えてなくなってしまうのです。

ごく希に純度よく精製できたとしても、その回収率はかなり悪いものでした。
次に、大量精製を試みると、全くと言っていいほど、うまくことは進みません。

実験するたびに、サンプルが消失してしまう。これは、研究に携わっている者にとって、かなりの恐怖心を招く現象です。

自分は実験が下手なために、そのような結果を招いているのか? それとも、無くなってしまうということをサンプルのせいへと責任転嫁してよいのかなど、多くの悩みが生じてしまうのです。

不安を打ち消すために、実験を行うのですが、結果はネガティブばかりです。

一時は暗礁に乗り上げかけた成長ホルモンの単離ですが、うまく行かななかった実験結果を並べて見ると、1つの法則みたいなものが浮かび上がってきたのです。

そして、ある「決断の時」がやってきました。


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2009年06月18日

マリンバイオの始まり、成長ホルモン物語

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内分泌研究(ホルモン研究)を魚の養殖への応用に結びつける場合、重要なキーワードは「成長」と「生殖」が挙げられ、成長ホルモンと生殖腺刺激ホルモンがクローズアップされます。

成長ホルモンは、その名前が示すように動物の体を大きくする作用を持っています。生殖腺刺激ホルモンは、卵や精子の成熟に重要なホルモンなのです。ところが魚の場合、これらホルモンの精製は大変な困難を伴いました。

それでは、成長ホルモンの話から進めましょう。

脳下垂体ホルモンからは、成長ホルモンが分泌されています。
この成長ホルモンはプロラクチンとよく似た構造をしているので、同じ祖先分子から分化したものと考えられています。いわゆる、兄弟あるいは姉妹関係といったわけですが、専門的には「同族タンパク質」と呼んでいます。

従って、プロラクチンと成長ホルモンは同じような分子量になるので、電気泳動を使ったホルモンの検出が期待できました。つまり、分子量22000〜23000くらいのタンパク質を追跡するのです。

サケの脳下垂体からホルモンを精製する場合、まず塩酸とアセトンの混合液を使って抽出します。この抽出物を出発材料にすると、プロラクチンは比較的簡単に精製できるのですが、クロマトグラフィー上でプロラクチンと違った挙動を示す分子量22000〜23000くらいのタンパク質は検出されない場合が多いのでした。

何度、脳下垂体の抽出を繰り返しても、成長ホルモンは、その姿が全然見えてこないのです。


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三陸産甘塩サクラマス1尾入り




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2009年06月15日

遂に解明された全アミノ酸配列

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構造解析のやり直しとなったサケのプロラクチン。

リジン残基のカルボキシ末端側で切断するリジルエンドペプチダーゼ、グルタミン酸残基ののカルボキシ末端側で切断するStaphylococcus V8プロテアーゼ、メチオニン残基のカルボキシ末端側を切断する臭化シアンなどで断片化したものを解析した結果、↓のようなアミノ酸配列になりました。
PIC135.jpg

サケのプロラクチンは187個のアミノ酸で構成されていて、4カ所にアミノ酸の変異がありました。

この研究成果は、哺乳類以外の脊椎動物でタンパク質性脳下垂体ホルモンのアミノ酸配列が解明された最初の例となったのです。

もし、高速液体クロマトグラフィーによって2つのプロラクチン分子に分離することが出来なかったならば、タンパク質化学的手法によるアミノ酸配列の決定は完了することなく終わっていたかもしれません。
そして、魚類のプロラクチンの構造解析は、後に研究の主流となってきた分子生物学的手法(遺伝子解析)に委ねられていたことでしょう。

このようなタンパク質化学的分析で成功したシロサケのプロラクチン研究は、成長ホルモンや生殖腺刺激ホルモンといったタンパク質ホルモンの研究に対して大きな影響を与えていくのでした。


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2009年06月12日

苦にならない実験のやり直し

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電気泳動では単一なバンドを示したことから、純度の高い精製品と思われていたサケのプロラクチンは、高速液体クロマトグラフィーによって2つの成分に分かれました。

この新事実によって、アミノ酸配列決定は出直しとなるのでした。

しかし、実験の失敗によってやり直すのとは訳が違い、これで正確な全構造が解明できるとあって、楽しい再検討です。

当時、最新鋭の分析技術であった高速液体クロマトグラフィーは、高い分離能と再現性の良さから、生体試料から精製されたペプチドホルモンと人工合成したホルモンの溶出パターンを比較して、提唱されたホルモンの構造が正確かどうかを証明するのにも使われていました。

このことを応用して、タンパク質の構造解析の場合、同じ条件下でタンパク分解酵素によって断片化し、それらを高速液体クロマトグラフィーで分離した時の溶出パターン(ペプチドマップと呼びます)を比較すると、構造の変異している箇所が特定できるのです。

次に、どのようなタンパク分解酵素を使うのがよいかを検討しなければなりません。
理想は、ある特定のアミノ酸残基の所だけで切断する酵素です。

そんな時、タイムリーなことに、リジン残基のカルボキシ末端側だけを切断する酵素(リジルエンドペプチダーゼ)が発売されました。

これなら、これまで使っていたトリプシンやサーモライシンのように細かく断片化されすぎずに、適度な大きさの断片が期待できます。

リジルエンドペプチダーゼ消化したプロラクチンのペプチドマップを比較した実験の結果は↓のようになり、溶出位置の異なる断片がいくつか見いだされました。

PIC134.jpg


つまり、PRL-IとPRL-IIでは同じアミノ酸配列をしているのではなく、数カ所にアミノ酸残基の変異があることが判ってきました。


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2009年06月10日

ぽっちゃりめのピークに福来たる

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TSK gel ODS-120Tカラムを使った高速液体クロマトグラフィーでは、サケのプロラクチンを回収することができました。

その時のレコーダーに記録されたピークの形状は、普段、見慣れたペプチドのピーク形状に比べて、かなり太めになっていました。

これは、「分子量の大きいタンパク質だから」という理由が考えられます。

ところが、このピークをよく観察すると、ピークの頂点がほんの少しへこんでいたのです。

ひょっとしたら、このプロラクチンのピークは2つに分かれるかもしれない。その時、直感的にそう感じたのでした。

それで、アセトニトリル濃度が40〜60%になるように、高速液体クロマトグラフィー装置のプログラムを変更します。

カラムの平衡化が完了し、プロラクチンを装置に導入すると、レコーダーのペンの動きに注目が集まりました。

試料を導入した時のノイズを記録した後、しばらくするとベースラインを書いていたペンがゆっくりとピークを描き始めました。そして、頂点まで達したペン先は下降線を描くようになります。

下降線を書いていたペンは徐々にその下降速度が遅くなり、一瞬止まったかのようになった後、再び上昇に転じたのでした。

そしてプロラクチンは、見事に2つのピークとして分離されたのです。

PIC133.jpg


このクロマトグラフィーでの溶出順に従い、最初に溶出してきたプロラクチン(prolactin:PRL)分子を「PRL-I」、遅れて溶出してくる分子を「PRL-II」と名称が付けられました。

「タンパク質ホルモンが高速液体クロマトグラフィーで分離・精製できる」という結果は、魚類の内分泌研究を飛躍的に発展させるきっかけになるのでした。


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2009年06月08日

常識はずれの実験

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魚であるシロサケの脳下垂体から精製したプロラクチンをタンパク質化学的に構造解析すると、パズルから外れてしまう断片化したペプチドが生じてきました。

「どうしても、当てはまらないフラグメント(断片化したペプチドのことです)がある」

とか

「繰り返し構造みたいなことを想定しても、それを証明するフラグメントがない」

など、いろいろ騒いでいると、ある日、教授がある真新しい高速液体クロマトグラフィーのカラムを持ってきて、「これにプロラクチンをかけてみろ」となりました。
(かけてみる = 分離・分析してみる)

カラムの入った箱をみると、「TSK gel ODS-120T」と書かれています。

ODSカラムとは、18個の炭素が直鎖状になったものを結合させたシリカ粒子を詰めたカラムで、当時は、「吸着させた分子量5000以上のタンパク質・ペプチドはODSから回収できない」ということが常識になっていました。

それを、分子量22,000もあるプロラクチンを分析することになったわけですから、誰しも頭の中は「???」状態です。

とにかく全構造を決めるには八方ふさがりだったので、「やれ」と言われたから、とにかく「やってみるか」という状況でした。

新しいカラムをセットした高速液体クロマトグラフィー装置のプログラムを5%から60%へとアセトニトリルの濃度勾配になるように設定します。

「どうせ、何も出てこないだろう」という雰囲気の中、分析を始めると、分析時間終了間近になって、1本のピークが現れました。

これには、全員驚きで、「これ何?」ってことになりました。

プロラクチン?、それともゴーストピークなのか?

それで、もう一度分析をトライすることに。

この時、カラムに導入するプロラクチンの量を前回より増やしてみると、前の結果よりも大きいピークとなって検出されました。

この事は、それまでの常識に反して「タンパク質ホルモンがODSカラムによって回収できる」という事実が生まれた瞬間であり、幸福への第一歩となったわけです。


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2009年06月04日

合わないパズル

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脳下垂体では「プロラクチン」というホルモンが作られています。

このホルモンは、動物の進化に伴って、その生理作用も変化してきたことで知られています。

例えば、哺乳動物では乳腺の発達や乳汁の合成や分泌などに係わっています。
これが淡水魚では、体内から外界へナトリウムイオンが流出しないようにしているのです。つまり、魚が水の中で水ぶくれにならないで生きていけるのは、このホルモンの作用によるものなのです。

シロサケの脳下垂体から精製されたプロラクチンは、SDSゲル電気泳動や等電点電気泳動などで単一バンドになることから、「極めて純度の高い」ホルモンとされていました。

ところが、タンパク分解酵素などを使って断片化し、それらのアミノ酸配列を決めた後に、配列の重なり合いを見ながら、プロラクチンの全アミノ酸配列を検討すると、どうしても余ってしまう断片があったのです。

何度もデータを見直して注意深く検討すると、はっきり言えたのは、「このジクソーパズルは完成しない」という結論だったのです。

最後までかみ合うことのない断片の存在。これでは、全構造を決めたことになりません。

なぜ、そうなってしまうのか?

答えを見つけられない日々が何日も続くのでした。


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2009年06月02日

手作り装置だったHPLC

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私、イソガニ博士が最初に出会った本格的な実験は、高速液体クロマトグラフィー(HPLCと略します)でした。1983年のことです。

これはタンパク質ホルモンのアミノ酸配列を決めるために、化学的試薬で切断した後、あるいは酵素消化した後に、断片化したペプチドとなったものを精製する手段として使っていました。

この高速液体クロマトグラフィーは、今では一般的な分析機器となりましたが、当時は普及し始めの頃で、研究室にあった装置自体はメーカーの完成品でなく、いくつかのパーツを組み合わせたものでした。

このクロマトグラフィーでは、溶離液としてイソプロパノールの濃度勾配をつけて試料を溶出させるわけですが、そのために、100mL用のメスシリンダーを2連につなげて作ったものが工夫されて使われていました。

ガラス細工を応用した手作りのグラージェント装置なのです。絵にするとこんな↓感じです。

PIC132.jpg


これを送液ポンプへと接続して、インジェクター、カラム、UV検出器、フラクションコレクターの順でステンレス製の送液管がつないでありました。

これでも、当時としては最先端の分離・分析技術だったので、いかにも「研究をしている」といった雰囲気を感じさせてくれるものでした。

もちろん、出てきたデータも一級品で、この装置から多くの論文が生み出されました。



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